在1940年的抗日战争时期，山东临城枣庄的铁路沿线上，一支英勇的铁道游击队活跃其中。他们神出鬼没，专门在交通要道上对敌人进行打击，有效地牵制了敌人的兵力部署。这支队伍由大队长刘洪和政委李正领导，他们在陈庄开设炭场作为掩护，多次成功袭击火车，不仅武装了自己，还向军区供应了一批急需的武器。因此，老百姓亲切地称他们为“飞虎队”。

当敌人小林部队调派特务队企图消灭飞虎队时，这些英雄并没有坐以待毙。他们先下手为强，接连袭击了洋行和客车，迫使敌人不得不将原计划进山“扫荡”的兵力撤回一部分来对付飞虎队。然而，飞虎队行动迅速且隐秘，得到了群众的广泛支持，使得敌人始终无法找到他们的踪迹。即便是狡猾的特务队长冈村也在这场较量中狼狈不堪。

面对日本侵略者和国民党反动派的联合围攻，刘洪负伤并暂住在芳林嫂家中养伤。这里逐渐成为了游击队领导集会的秘密地点。在共同的斗争中，芳林嫂和刘洪之间渐渐萌生了爱意。但好景不长，冈村侦察到了游击队的藏身之处并发动了突然袭击。刘洪和李正迅速反应，成功打了个反包围，歼灭了敌人，但冈村却逃脱了。

愤怒不已的敌人开始到处放火焚烧村庄进行报复。敌人的暴行彻底激怒了刘洪，他决定在微山湖与敌人决战。然而李正赶来阻止时却不幸负伤。好在队伍听从了命令及时撤退才免遭损失。经过休整飞虎队的力量进一步壮大。

此时太平洋战争爆发日军军运更加繁忙。刘洪率队不断在铁道上出击令敌人应接不暇。为了全歼铁道游击队小林不得不调集鲁南地区全部兵力进攻微山湖。在一场巧妙的化装成日军的突围行动中飞虎队遇到了冈村经过一场激战全歼了冈村特务队冈村也命丧黄泉。

不幸的是芳林嫂在湖西侦察时被俘。1945年抗战胜利李正伤愈归队并带来了新的任务：插入临城阻止蒋匪军北窜同时迫使小林部队投降。飞虎队成功打击了企图北窜的蒋匪军救出了芳林嫂并俘虏了逃跑的小林及其残兵败将。最终铁道游击队的力量更加壮大了。

在这部电影的演职员表中曹会渠饰演了英勇善战的铁道游击队大队长刘洪；秦怡饰演了坚强勇敢的飞虎队堡垒户芳林嫂；冯喆则饰演了足智多谋的铁道游击队政委李正。此外还有冯奇、冯笑、邓楠、仲星火等众多优秀演员共同塑造了铁道游击队的英雄群像而陈述、郑敏、石灵等演员则成功演绎了敌人的角色。